ĐỊNH LƯỢNG GEN BỆNH MÁU ÁC TÍNH BẰNG KỸ THUẬT REALTIME PCR
QUANTITATIVE REAL - TIME PCR OF GENES INVOLVED IN
MALIGNANT HEMATOPOIETIC DISEASES
NGUYÊN LÝ
dùng phương pháp Real - time - PCR định lượng ARNm của gen ung thư nhằm mục đích dự đoán thời điểm bệnh tái phát để ngăn chặn trước khi tái phát. Dựa trên sự kiểm soát lượng huỳnh quang tiêu tốn trong phản ứng có thân xác định số lượng ARNm của gen ung thư tại thời khắc đó. Đồng thời trong phản ứng định lượng cùng lúc 2 gen: gen ung thư cần theo dõi và gen tham chiếu (housekeeping gen - là gen có tốc độ biểu hiện như nhau ở cả tế bào ung thư và tế bào lành) sẽ cho phép đánh giá mức độ hoạt động của gen ung thư so với gen tham chiếu ở cùng một thời khắc trong cả thảy quá trình theo dõi chuẩn y tỷ lệ số lượng ARNm của gen ung thư/số lượng ARNm gen tham chiếu. Số lượng ARNm của gen ung thư tăng dần là đấu hiệu gen ung thư bắt đầu hoạt động trở lại.
CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định trước và trong suốt quá trình điều trị cho các người bệnh đang điều trị theo phác đồ nhắm đích.
CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
CHUẨN BỊ
Người thực hành
Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo
công cụ - Hóa chất
Phương tiện
Hệ thống máy real - time PCR
Tủ hút hóa chất (chemical fume hood)
Buồng vô trùng (biology cabinet).
Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút).
Máy vortex.
Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl.
Đầu côn có màng lọc.
Ống eppendorf 1,5 ml khử trùng, không có enzym nucleaza.
Ống PCR 0,2 ml khử trùng, không có enzym nucleaza.
Tủ lạnh 4 - 8 0 C, tủ âm sâu - 20 0 C.
căng thẳng.
Hóa chất
Dung dịch Ficoll hoặc dung dịch ly giải tế bào hồng huyết cầu gồm các muối MgCl2, Tris - HCl, NaCl.
sử dụng kit tách ARN thương mại. Nếu tách thủ công thì dùng các sinh phẩm cấp thiết để tách chiết ARN như glycogen, proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
Hóa chất cho phản ứng định lượng thể hiện gen: kit thương mại. Nếu không dùng kit thương mại thì dùng các thành phần riêng lẻ như: Đệm, MgCl 2 , dNTPs, enzym phiên mã ngược, enzym kéo dài chuỗi, mồi oligodT hoặc mồi ngẫu nhiên (random primer), các cặp mồi và probe đặc hiệu, nước khử ion sát trùng.
Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi hoặc dịch tủy xương chống đông bằng EDTA
Tiến hành kỹ thuật
Bước 1: Tách chiết ARN
Xem bài “Tách chiết ARN từ máu ngoại vi/tủy xương
Bước 2: Thực hiện phản ứng ADNc
dùng mồi tình cờ 6 nucleotit (random hexamer primers) và enzym Reverse Transcriptase để chuyển hóa ARN thành ADN duyệt y các chu trình nhiệt chuyên biệt.
Bước 3: Thực hiện phản ứng real - time PCR
Chuẩn bị các mẫu chuẩn:
Mỗi loại gen cần định lượng phải có tối thiểu 3 mẫu chuẩn (mẫu chuẩn là các mẫu ARN đích đã biết trước nồng độ, thường dùng mẫu chuẩn ở 3 độ pha loãng liên tục) và một mẫu đối chứng âm để kiểm soát ngoại nhiễm (thường sử dụng H 2 0 đã khử các enzym phân hủy ADN và ARN hoặc đệm Tris - EDTA 1M, pH=7,5).
Chuẩn bị phản ứng:
Ghi tên các ống theo trật tự.
Mỗi ống phản ứng bổ sung đủ các thành phần phản ứng:
+ Sản phẩm ADNc + master mix theo nồng độ khuyến cáo (nếu dùng kit định lượng chế tạo sẵn).
+ Sản phẩm ADNc + buffer+ enzym+ primer+ probe theo đúng nồng độ đã tối ưu (nếu sử dụng các thành phần riêng lẻ).
Đặt các ống phản ứng vào các vị trí trên máy.
Chuẩn bị chương trình trên máy
Cài đặt sơ đồ giếng theo đúng các vị trí ống đã đặt trên máy, nhập thông tin mẫu và các nồng độ mẫu chuẩn theo đúng yêu cầu, chọn kênh màu huỳnh quang cân xứng.
Cài đặt chương trình chạy theo chế độ luân nhiệt khuyến cáo của kit hoặc chế độ luân nhiệt đã tối ưu được.
Chọn vị trí lưu kết quả sau khi chấm dứt chương trình chạy.
Bấm start để bắt đầu chạy theo chương trình đã chọn.
Bước 4: phân tích kết quả
Sau khi chấm dứt chương trình chạy, hết thảy các kết quả được hiển thị lên màn hình.
thẩm tra các đường chuẩn và mẫu đối chứng âm trước.
+ Nếu đạt đề nghị (theo hướng dẫn của kit dùng hoặc theo kết quả lý thuyết đã tối ưu) thì tiếp chuyện phân tách các mẫu khác theo kết quả thu được.
+ Nếu không đạt yêu cầu (mẫu chuẩn không có tín hiệu huỳnh quang, mẫu đối chứng âm bị nhiễm thành dương tính….) thì không đủ cơ sở để phân tách các mẫu khác. Trong trường hợp này phải lặp lại xét nghiệm sau khi đã tìm ra căn nguyên SAI SÓT ở xét nghiệm trước.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Nhận định kết quả theo các kết quả thu được bằng cách tính nết tỷ lệ ARNm gen ung thư/ ARNm gen tham chiếu.
NHỮNG sơ sót VÀ XỬ TRÍ
|
SAI SÓT |
XỬ TRÍ |
|
Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông. |
thực hành đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu. |
|
Thao tác pipet không chuẩn xác. |
sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định. |
|
Tín hiệu phản ứng không rõ ràng. |
Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sinh sản thực hành đúng, đủ các bước trong quy trình xét nghiệm. |
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Phạm Hùng Vân (2009). Real - time PCR. PCR và Realtime PCR - các vấn đề căn bản và các vận dụng thường gặp. Nhà xuất bản y khoa, trang 60 - 65.
J Gabert et at (2003). Standardization and quality control studies of “realtime” quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - A Europe Agains Cancer . Leukemia 17, 2318 - 2357.
Hanya blogger biasa yang suka berkelana di dunia maya mencari seonggok informasi yang kiranya dapat berguna untuk dirinya. Terimakasih telah membacanya.
