XÉT NGHIỆM CD55/CD59 bạch cầu
(White blood cell CD55/CD59 analysis by flow cytometry)
NGUYÊN LÝ
Đái huyết sắc tố kích phát ban đêm là một bệnh rối loạn tế bào gốc tạo máu. Đột biến xảy ra ở tế bào gốc tạo máu làm mất gen GPI - A, gen này tổng hợp protein gắn màng glycosyl - phosphatidylinositol (GPI). Do mất hoặc thiếu hụt các GPI nên các protein gắn màng (như CD55, CD59) gắn ít hoặc không gắn được lên màng tế bào hồng cầu do vậy không bảo vệ được tế bào trước sự tấn công của bổ thể, dẫn tới các tế bào hồng cầu dễ bị hoạt hóa bởi bổ thể và gây vỡ hồng huyết cầu.
Trên phân tích tế bào dòng chảy, tế bào máu ngoại vi ủ với anti CD45 sau ly giải hồng huyết cầu sẽ phân bổ thành 3 vùng quần thể rõ rệt: vùng bạch cầu hạt, vùng mono, và vùng lympho.
Dựa trên các đặc tính này, kỹ thuật flow cytometry sử dụng các kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang để phát hiện sự có mặt, thiếu hụt, hoặc mất các thụ thể CD55 và/hoặc CD59 trên các quần thể tế bào bạch huyết cầu. Từ đó góp phần chẩn đoán xác định bệnh đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm.
CHỈ ĐỊNH
Suy tủy xương, nghĩ đến bệnh đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm.
CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
CHUẨN BỊ
Người thực hành
Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
thầy thuốc xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
công cụ, hóa chất.
công cụ
Máy phân tích tế bào dòng chảy (máy flow cytometer);
Máy ly tâm;
Máy lắc trộn;
Pipet man và đầu pipet loại 250 µl và 1000 µl;
ống thử flow cytometry (chuyên dụng cho máy phân tách tế bào dòng chảy).
bít tất tay.
Hóa chất
Anti CD45 - PC5;
Anti CD55 - PE;
Anti CD59 - FITC;
Dung dịch ly giải hồng huyết cầu;
Dung dịch sheath chạy máy flow;
Dung dịch đệm PBS.
Nước cất, hoá chất tiệt trùng Natri hypoclorite.
Bệnh phẩm
Là mẫu máu ngoại vi chống đông bằng EDTA. Mẫu được lấy từ các người bệnh nghi ngờ đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm và người bệnh có hội chứng rối loạn sinh tủy.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Lấy bệnh phẩm
2ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA;
Mẫu cần được ủ kháng thể ngay trong vòng 6 giờ sau lấy mẫu.
Tiến hành kỹ thuật
Chuẩn bị mẫu
Lấy 100 µl máu cho vào 1 Ống nghiệm flow cytometry.
Ly giải hồng huyết cầu bằng 1 ml dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Ly tâm rửa huyền dịch tế bào sau ly giải hồng cầu 2 lần, mỗi làn làm như sau: thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn lắc đều và ly tâm 2000 vòng/phút trong 3 phút. Đổ bỏ dịch nổi, để lại cặn tế bào và lượng dịch còn lại (khoảng 100 µl). Trộn đều cặn và lượng dịch còn lại.
Ủ kháng thể
Cho kháng thể anti CD45 - PC5, anti CD55 - PE, anti CD59 - FITC (mỗi loại 20 l) vào ống flow cytometry chứa cặn tế bào đã phá hồng cầu ở bước trên. Trộn đều và ủ nhiệt độ phòng 20 phút, tránh ánh sáng.
Rửa bỏ kháng thể thừa: sau ủ, thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn đều và ly tâm 2000 vòng/phút trong 3 phút. Đổ bỏ dịch nổi, để lại cặn tế bào.
Thêm 1 ml PBS vào ống cặn tế bào, trộn đều. Lúc này ống đã sẵn sàng cho phân tách.
phân tích CD55, CD59 bạch cầu trên máy flow cytometry
Đưa ống flow cytometry vào vị trí đọc trên máy.
Mở chương trình phân tích CD55, CD59 bạch cầu đã lập sẵn trên máy.
Nhập vị trí ống phân tích và chạy chương trình phần mềm phân tích.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
chính yếu quan sát phân tách trên quần thể bạch cầu mono và bạch cầu hạt, vùng bạch huyết cầu lympho không thấy rõ sự biến đổi.
Nếu chừng độ dương tính CD55 và/hoặc CD59 của quần thể bạch cầu hạt và bạch cầu mono nằm trong giới hạn thường nhật (dương tính 95%): không có thiếu hụt hoặc mất CD55, CD59 bạch cầu.
Nếu mức độ dương tính CD55 và/hoặc CD59 của quần thể bạch cầu hạt và bạch cầu mono thấp ≤ 95% (dương tính ≤ 95%): có thiếu hụt và mất CD55 và/hoặc CD59 bạch huyết cầu. Đây là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán bệnh Đái huyết sắc tố kịch phát ban đêm.
thường nhật: Không có thiếu hụt CD55 và/hoặc CD59 ở các quần thể bạch cầu hạt và mono (CD55/CD59 bạch cầu dương tính 95%).
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
sơ sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.
Xử trí: đề nghị nơi đưa mẫu xác minh lại các thông báo cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
Các tế bào bạch cầu nằm không đúng vùng tế bào trong cửa sổ chương trình chạy. nguyên cớ có thể do thực hành không đúng, lượng kháng thể ủ không đủ, thực hiện không đủ các bước của quy trình, ủ không đủ thời kì, hút pipet không tốt, tắc kim hút trên máy…
Xử trí: Làm lại xét nghiệm và tuân theo đúng quy trình. rà máy trước khi phân tách, phải rửa máy, đuổi bọt khí và thông kim hút (nếu cần) theo hướng dẫn đi theo máy.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Beckman Coulter. 2011. IOTest CD45 - PC5 Used manual .
Beckman Coulter. 2011. IOTest CD55 - PE Used manual.
Beckman Coulter. 2011. IOTest CD59 - FITC Used manual.
Hanya blogger biasa yang suka berkelana di dunia maya mencari seonggok informasi yang kiranya dapat berguna untuk dirinya. Terimakasih telah membacanya.
