CẤY hỗn hợp TẾ BÀO LYMPHO
MIXED LYMPHOCYTE CULTURE
NGUYÊN LÝ
Khi nuôi cấy tế bào lympho nếu trong môi trường có kháng nguyên lạ, tế bào lympho sẽ non hóa và nhân lên. Cấy hỗn hợp là đưa tế bào lympho của người cho đã bất hoạt bằng mitomicin C hoặc chiếu xạ cho tiếp xúc với tế bào lympho của người nhận. Nếu tế bào lympho của người nhận mẫn cảm hoặc phản ứng với kháng nguyên trên tế bào lympho của người cho càng mạnh thì số lượng tế bào lympho của người nhận non hóa và nhân lên càng nhiều. Tế bào nhân lên dùng các bazơ nitơ tự do để tổng hợp ADN. Do đó, có thể ước tính được chừng độ phản ứng bằng cách cho thêm [ 3 H] thimidine (là một loại bazơ nitơ có gắn đồng vị phóng xạ) vào môi trường nuôi cấy để phân tích lượng chất đồng vị phóng xạ dùng để đánh dấu này được dùng khi tế bào lympho của người nhận nhân lên.
Cấy hỗn tạp lympho chủ yếu dùng trong việc đánh giá chừng độ hòa hợp kháng nguyên của người cho và người nhận trước khi ghép tạng. ngoại giả, nó có thể được dùng để nghiên cứu các đáp ứng miễn nhiễm ở mức độ tế bào.
CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định trong trường hợp cần đánh giá mức độ hòa hợp kháng nguyên của người cho và người nhận trước khi ghép tạng.
CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm đã được đào tạo kỹ thuật XN miễn nhiễm – di truyền.
Phương tiện - Hóa chất
dụng cụ
Thiết bị: tủ ấm CO2, máy ly tâm lạnh, máy đếm phóng xạ lập loè lỏng, kính hiển vi đảo ngược, pipet man.
phương tiện: ống nghiệm khử trùng, đĩa nuôi cấy 96 giếng 0,2 ml, bơm kim tiêm, đầu côn lọc.
Hóa chất
Môi trường RF10 - M: 100 ml bao gồm:
+ 86 ml môi trường RPMI.
+ 10 ml huyết thanh bào thai bê.
+ 0.1 ml 2 – mercaptoethanol nồng độ 5x10 - 2 M.
+ 1 ml kháng sinh streptomycin 10mg/ml + penicilin 10,000UI/ml.
+ 1 ml L - glutamin 200 mM.
+ 2 ml Hepes buffer 1 M.
[ 3 H] thymidine.
Lymphoprep.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Lấy bệnh phẩm
04 ml máu toàn phần của người bệnh cần ghép và người cho chống đông bằng heparin 5.000 đơn vị/ml.
Tiến hành kỹ thuật
Tách tế bào lympho:
+ Chuẩn bị 2 ống thử khử trùng có 2ml lymphoprep.
+ Cho 4 ml máu ngoại vi của người cho và người nhận vào 2 ống nghiệm trên.
+ Ly tâm tốc độ 2500 vòng/phút trong 15 phút để tách tế bào lympho.
+ Hút cẩn thận tuốt luốt lớp tế bào đơn nhân ở giữa và cho vào 2 ống thử vô trùng.
Tái huyền dịch tế bào lympho vào môi trường RF10 - M.
Cho thêm 100 µl mitomycin C nồng độ 50 µg/ml vào ống thử chứa tế bào lympho của người cho trong 20 phút để bất hoạt tế bào lympho.
Cho thêm 2 ml RF10 - M vào ống nghiệm đã được xử lý với mitomicin C.
Ly tâm tốc độ1.000 vòng/ 10 phút và bỏ dịch nổi. Lặp lại bước rửa này 03 lần.
Cho 100 µl huyền dịch tế bào lympho của người nhận có nồng độ tế bào 2 x 10 5 /ml vào giếng của phiến nuôi cấy 96 giếng (cho vào 3 giếng).
Cho tiếp 100 µl huyền dịch tế bào lympho đã bất hoạt của người cho có nồng độ tế bào 5 x 10 6 (cả 3 giếng nêu trên).
Cho 200 µl huyền dịch tế bào lympho của người nhận có nồng độ tế bào 2 x 10 5 /ml vào giếng thứ 4 của phiến nuôi cấy 96 giếng làm chứng âm.
Đặt phiến nuôi cấy vào tủ ấm 37 o C, 5% CO 2 trong 78 giờ.
Cho 1 µCi [ 3 H] Thymidine vào mỗi giếng (cả 4 giếng nêu trên), đặt phiến nuôi cấy vào tủ ấm 37 o C, 5% CO2 trong 18 giờ.
Thu hoạch tế bào và đọc kết quả trên máy đếm nhấp nháy lỏng theo cơ chế đơn vị đếm được tính theo đơn vị phóng xạ (cpm).
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
dùng phần mềm phân tách kết quả đối chiếu giữa các giếng chứng và giếng thực nghiệm.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Không bảo đảm khử trùng: Cần thao tác và chuẩn bị Dụng cụ, môi trường vô khuẩn, khử khuẩn khu vực thực hiện chí ít 15 phút trước khi thực hành kỹ thuật.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Greg A. Perry, (1976), “ Mixed Lymphocyte culture”, Creigton university.
John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober, (1991), Current protocols in immunology, John Wiley & Son Press.
Hanya blogger biasa yang suka berkelana di dunia maya mencari seonggok informasi yang kiranya dapat berguna untuk dirinya. Terimakasih telah membacanya.
