PHÁT HIỆN NGƯỜI MANG GEN HEMOPHILIA
(Bằng kỹ thuật PCR - RFLP)
DETECTION OF HEMOPHILIA CARRIER BY PCR - RFLP
NGUYÊN LÝ
Tính đa hình (polymorphism) của một số đoạn gen là hiện tượng khác nhau một hoặc một nhóm nucleotid ở một vị trí nhất thiết trên gen nhưng không làm thay đổi hoạt động của gen. Các đa hình này thường nằm trong lớp lang nhận biết của một hoặc một số enzym giới hạn và có thể được phát hiện khi sử dụng kỹ thuật PCR - RFLP. Xác định đa hình đặc trưng ở người bệnh hemophilia, sau đó dùng đa hình này để dạo cá thể mang gen trong gia đình dựa trên nguyên tắc các gen nằm gần nhau thì di truyền cùng nhau. trước tiên, dùng kỹ thuật PCR để nhân văn đoạn gen quan tâm có chứa gen đa hình, sau đó cắt sản phẩm PCR này với một enzym giới hạn đặc hiệu với vị trí đa hình. Quan sát các sản phẩm cắt, sẽ nhận dạng được gen.
yêu cầu để thực hiện kỹ thuật:
+ Phải biết người mẹ là người chắc chắn mang gen hemophilia (carrier) và cần phải xét nghiệm đặc tính đa hình của gen ở người mẹ, người mẹ phải là người dị hợp tử với đặc tính đa hình.
+ Phải xét nghiệm đặc tính đa hình của bố và của người bệnh hemophilia (là anh trai hoặc em trai của người cần phát hiện hoặc người bệnh là một người nam giới hệ trọng khác như bác ruột về phía mẹ).
CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định cho tất tật những người phụ nữ trong gia đình có tiền sử mắc bệnh Hemophilia mà có nhu cầu xác định tình trạng mang gen.
CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
CHUẨN BỊ
Người thực hành
Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh vật học phân tử đã được đào tạo.
công cụ - Hóa chất
công cụ
Máy PCR;
Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh;
Buồng khử trùng (biology cabinet);
Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
Máy vortex;
Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
Đầu côn có màng lọc;
Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
Ống PCR 0,2 ml diệt trùng, không có enzym nucleaza;
Tủ lạnh 4 - 8 o C, tủ âm sâu - 20 0 C;
bít tất tay.
Hóa chất
dùng kit tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì dùng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ADN như proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl 2 , dNTPs, enzym kéo dài chuỗi, nước khử ion vô trùng, các cặp mồi đặc hiệu.
Hóa chất điện di: thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN, thuốc nhuộm ethidium bromide.
Bệnh phẩm
ml máu ngoại vi (của mỗi thành viên) đựng trong ống chống đông EDTA.
Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cấp thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Lấy bệnh phẩm
ml máu ngoại vi (của mỗi thành viên) đựng trong ống chống đông EDTA.
Tiến hành kỹ thuật
Bước 1: Tách chiết ADN
Xem bài “ Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”.
Bước 2: PCR
thực hành phản ứng PCR với sự dự của các thành phần sau :
PCR buffer 10X 5 µl
ADN 100 ng
Forward primer (10pM) 1 µl
Reverse primer (10pM) 1 µl
Taq - polymerase 0.5 U
H 2 0 đủ thể tích 50 µl
Bước 3: Cắt với enzym giới hạn
thực hành phản ứng cắt bằng enzym giới hạn với các thành phần sau : Đệm hợp với enzym giới hạn 3 µl Sản phẩm PCR 20 - 25 µl
Enzym giới hạn 2 µl
H 2 0 đủ thể tích 30 µl
Bước 4: Điện di rà soát sản phẩm cắt
dùng 20 - 25 µl sản phẩm cắt cùng với 10 µl sản phẩm PCR và thang ADN chuẩn (marker) điện di trên gel agarose. Tùy thuộc kích thước đoạn gen cần quan sát mà chọn nồng độ gel agarose và thời kì chạy điện di ăn nhập.
Sau đó kết quả được đọc và phân tách duyệt hình ảnh soi trên đèn U
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sản phẩm PCR phải có băng đặc hiệu, đúng kích thước theo tính tình lý thuyết.
Nếu sản phẩm cắt có 2 băng ADN trở lên tức là có vị trí nhận biết của enzym giới hạn (không có đa hình)
Nếu sản phẩm cắt vẫn còn nguyên sản phẩm PCR tức là mất vị trí nhận biết của enzym giới hạn (có đa hình).
Phương pháp phát hiện các đa hình gen đặc trưng ở người bệnh hemophilia sau đó sử dụng các đa hình này để kiếm cá thể mang gen trong gia đình là phương pháp đã được thực hiện từ lâu trên thế giới. Ưu điểm của phương pháp là kỹ thuật thực hành đơn giản, không cần phải đầu tư nhiều trang thiết bị đắt tiền và uổng để thực hành xét nghiệm thấp.
Tuy nhiên phương pháp này đề nghị phải lấy mẫu của nhiều thành viên trong gia đình song song phải biết được các đa hình có tần suất cao ở Việt nam.
Cách xác định tình trạng mang gen của một người nữ trong gia đình có người bệnh hemophilia :
Lấy mẫu: ba má của người nữ cần xác định, người bệnh là anh trai hoặc em trai hoặc một người nam giới liên quan khác như bác ruột về phía mẹ.
Cách phân tách:
+ phân tách người bệnh để xác định được allen can hệ đến gen nhân tố VIII đột biến.
+ phân tách bố, mẹ để xác định di truyền của các allen (allen thông thường và allen can hệ đến gen đột biến) cho các con. Trong đó người mẹ ép phải là thể dị hợp tử với đa hình phân tích. phân tích mẫu của bố sẽ xác định được allen truyền cho con gái.
phối hợp các kết quả phân tích trên sẽ xác định được người đàn bà mang gen trong gia đình.
NHỮNG sơ sót VÀ XỬ TRÍ
|
SAI SÓT |
XỬ TRÍ |
|
Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông. |
thực hành theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu. |
|
Thao tác pipet không xác thực. |
dùng pipet theo đúng thể tích quy định. |
|
Tín hiệu phản ứng không rõ ràng. |
Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất thực hiện đúng, đủ các bước trong quy trình xét nghiệm. |
TÀI LIỆU THAM KHẢO
D J Bowen. Haemophilia A and Haemophilia B: molecular insights . J Clin Pathol: Mol Pathol 2002; 55: 1 - 8
Keeney S et al. The molecular analysis of haemophilia A: a guideline from the UK Haemophilia Centre Doctors' Organization Haemophilia Genetics Laboratory Network . Haemophilia 2005; 11: 387 - 97
Hanya blogger biasa yang suka berkelana di dunia maya mencari seonggok informasi yang kiranya dapat berguna untuk dirinya. Terimakasih telah membacanya.
