TÁCH CHIẾT ADN TỪ MÁU NGOẠI VI/ MÁU CUỐNG RỐN
DNA ISOLATION FROM PERIPHERAL BLOOD CELLS
NGUYÊN LÝ
Các tế bào có nhân đều chứa ADN - vật chất di truyền của thảy cơ thể. ADN nằm trên thể nhiễm sắc bên trong nhân tế bào. Để tách được ADN người ta thường dùng các chất tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân, kết hợp với Sử dụng các chất biến tính mạnh để loại bỏ các protein sau đó Sử dụng cồn 96 o kết hợp với điều kiện nhiệt độ thấp để thu được ADN một cách tinh sạch và nguyên lành.
CHỈ ĐỊNH
dùng cho tất thảy người bệnh có chỉ định làm xét nghiệm PCR.
CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
CHUẨN BỊ
Người Thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh vật học phân tử đã được đào tạo.
công cụ - Hóa chất
công cụ
Buồng sát trùng (biology cabinet);
Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
Máy vortex;
Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
Đầu côn có màng lọc;
Ống eppendorf 1,5 ml sát trùng, không có enzym nucleaza;
Ống PCR 0,2 ml sát trùng, không có enzym nucleaza;
Tủ lạnh 4 - 8 0 C, tủ âm sâu - 20 0 C;
bít tất tay.
Hóa chất
Sử dụng kit tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì Sử dụng các sinh phẩm cấp thiết để tách chiết ADN như proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
Bệnh phẩm
2ml máu ngoại vi/máu cuống rốn chống đông bằng EDTA.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Lấy bệnh phẩm
2ml máu ngoại vi/máu cuống rốn chống đông bằng EDTA.
Tiến hành kỹ thuật
Phương pháp tách chiết ADN căn bản bao gồm các thời đoạn chính sau:
Phá màng tế bào và màng nhân:
Bệnh phẩm được ủ trong một dung dịch gồm chất tẩy mạnh (như SDS, sarcosyl) và enzym phân hủy protein (proteinaza K). đích của bước ủ này là để phá màng tế bào và màng nhân song song để ức chế hoạt động của các enzym ADNaza nội bào và tách protein ra khỏi các phân tử ADN.
Loại bỏ các protein :
Sử dụng dung dịch phenol/chloroform để biến tính protein, làm cho protein tạo thành một lớp tủa rõ rệt sau khi ly tâm, dễ dàng loại bỏ khỏi hỗn dịch.
Kết tủa ADN:
dùng cồn để tủa ADN trong điều kiện lạnh và thu nhận lại ADN bằng ly tâm. ADN cần phải hòa lại trong nước khử enzym nucleaza.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
dùng 5µl ADN thu được để điện di rà trên gel agarose 0,5 - 0,8%, song song đo độ sạch bằng quang phổ (A260/A280). Chất lượng ADN tốt nếu chỉ xuất hiện một băng có kích thức lớn 10 kb và tinh sạch nếu A260/A280 trong khoảng 1,8 - 2,0.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
|
sơ sót |
XỬ TRÍ |
|
Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông. |
Thực hiện theo đúng chỉ dẫn qui cách lấy mẫu. |
|
Thao tác pipet không xác thực. |
Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định. |
|
Tín hiệu phản ứng không rõ ràng. |
Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất Thực hiện đúng, đủ các bước trong quy trình xét nghiệm. |
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997). Các phương pháp tách chiết axit nucleic. sinh vật học phân tử . NXB Giáo Dục, trang 124 - 125.
A.Rolfs et at (1992). PCR: Clinical Diagnosis and Research. Springer Verlag, Berlin.
Hanya blogger biasa yang suka berkelana di dunia maya mencari seonggok informasi yang kiranya dapat berguna untuk dirinya. Terimakasih telah membacanya.
