Kỹ thuật miễn dịch sử dụng trong chẩn đoán vi sinh vật
BẢN CHẤT CỦA SỰ phối hợp GIỮA KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ
Sự phối hợp giữa kháng nguyên và kháng thể phụ thuộc vào cấu trúc bề mặt của kháng nguyên và kháng thể. Sự phối hợp này xảy ra giữa một phần rất giới hạn giữa phân tử kháng nguyên (nhóm quyết định) và một phần rất giới hạn của phân tử kháng thể (trọng tâm hoạt động).
Theo Pauling, phân tử kháng thể thường hóa trị hai tức là cùng một lúc có thể kết hợp với hai phân tử kháng nguyên. Còn kháng nguyên đa hóa trị nên cùng một lúc có thể phối hợp với nhiều phân tử kháng thể. bởi thế kháng nguyên và kháng thể phối hợp với nhau để tạo thành một phức hợp hình mạng lưới trong không gian ba chiều. Vì kích tấc quá lớn nên phức hợp kết tủa hoặc ngưng kết.
Kháng nguyên và kháng thể có thể kết hợp với nhau theo bất cứ tỷ lệ nào nhưng phản ứng yếu đi nếu thừa hoặc thiếu kháng nguyên hoặc kháng thể. Phản ứng rõ rệt nhất lúc số phân tử kháng nguyên tương đương với số phân tử kháng thể.
Sự kết hợp giữa phân tử kháng nguyên và kháng thể xảy ra nhờ các lực như: lực kết liên ion (lực tĩnh điện Coulomb) giữa các nguyên tử hoặc các nhóm hoá học mang điện trái dấu, tỉ dụ giữa NH 3 + và COO - , lực kết liên của các cầu nối hydro giữa các nguyên tử hydro mang điện tích dương với các nguyên tử mang điện tích âm, lực Van der Walls (lực hấp dẫn liên phân tử) giữa hai phân tử phụ thuộc vào tương tác giữa các lớp mây điện tử ở mặt ngoài và lực ố thuỷ nếu ở diện xúc tiếp cả phía kháng nguyên và kháng thể đều có các axít amin ố thuỷ thì khi kháng nguyên kháng thể kết hợp, nước sẽ bị đẩy ra tạo nên một lực gắn giữa các axít amin ố thuỷ đó, sự phối hợp này không phải là một phản ứng hóa học.
Phản ứng phối hợp giữa kháng nguyên và kháng thể rất đặc hiệu. Một kháng nguyên chỉ phối hợp với kháng thể do nó kích thích cơ thể tạo thành. Do đó phản ứng phối hợp kháng nguyên - kháng thể được dùng để xác định kháng nguyên hoặc kháng thể nếu một trong hai phân tử đã biết.
Hiệu giá của kháng thể ở trong huyết thanh người hoặc động vật có thân xác định nhờ kháng nguyên đã biết và do đó cho biết sự tiếp xúc trước đó với kháng nguyên. trái lại nhờ kháng thể đã biết những kháng nguyên khác nhau của một vi sinh vật có thể nhận mặt. Mặt khác sự hiểu biết cấu tạo kháng nguyên cho phép tuyển lựa thích đáng vi sinh vật dùng làm vaccine đề phòng bệnh nhiễm trùng.
PHẢN ỨNG KẾT TỦA
Nguyên lý
Phản ứng kết tủa là sự phối hợp giữa kháng nguyên hòa tan lúc gặp kháng thể tương ứng, tạo thành tủa có thể quan sát trực tiếp bằng mắt thường hoặc nhờ soi kính lúp.
Kháng nguyên đa hóa trị kết hợp với kháng thể hóa trị hai để tạo thành kết tủa hình mạng lưới 3 chiều. Phản ứng có thể thực hành ở môi trường lỏng hoặc môi trường gel.
Phản ứng kết tủa ở môi trường lỏng
Phản ứng định tính
Được thực hành với kháng huyết thanh pha loãng hoặc không pha loãng. Kháng huyết thanh và kháng nguyên được trộn với nhau và quan sát kết tủa tạo thành. Cũng có thể cho kháng huyết thanh vào một ống nghiệm nhỏ rồi sau đó cho kháng nguyên dần dần vào theo thành ống. Một vòng kết tủa được quan sát ở mặt phẳng phân cách.
Phản ứng định lượng
Cho phép xác định lượng kháng thể kết tủa với một lượng kháng nguyên đã biết. Cho một lượng kháng nguyên tăng dần vào một lượng kháng huyết thanh không đổi,lấy kết tủa bằng ly tâm và định lượng protein bằng những phương pháp thông thường để xác định lượng kháng thể đã phản ứng.
Phản ứng kết tủa ở môi trường gel
Phản ứng khuếch tán đôi Ouchterlony
Kháng nguyên và kháng thể được đặt vào những lỗ đục ở trong thạch. Chúng khuếch tán và tạo nên những đường kết tủa ở trên mặt thạch. Một phẩm vật chứa nhiều kháng nguyên tạo thành nhiều đường kết tủa.
Những liên quan miễn dịch giữa hai kháng nguyên có thể khảo sát bằng phản ứng khuếch tán đôi. Những dải kết tủa tạo thành có thể cho biết sự tương đồng miễn dịch, sự đồng nhất từng phần hoặc sự không liên tưởng.
Phản ứng khuếch tán đơn
Có thể làm cho sự khuếch tán ở môi trường gel nhạy hơn bằng cách trộn kháng thể vào thạch. Kháng nguyên được cho khuếch tán từ một lỗ đục ở trên môi trường thạch chứa kháng thể. Lúc bắt đầu khuếch tán, kháng nguyên còn ở nồng độ cao nên tạo thành những phức hợp hòa tan. Lúc khuếch tán xa hơn, nồng độ hạ dần cho đến khi đạt một trị số thích ứng ở đó vòng kết tủa được tạo thành. Phương pháp này không những có thể áp dụng để nhận mặt kháng nguyên mà còn có thể cho phép định lượng IgG ở trong huyết thanh.
PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT
Nguyên lý
Phản ứng ngưng kết là sự phối hợp giữa kháng nguyên hữu hình với kháng thể ứng, tạo thành các hạt ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường.
Kháng nguyên có thể là vi khuẩn, hồng cầu, bạch huyết cầu, tinh trùng.v.v... Phản ứng ngưng kết chi xảy ra nếu có chất điện giải, rõ nhất, nhanh nhất ở pH từ 7 đến 7,2 và ở nhiệt độ 37 0 C.
Phản ứng ngưng kết trực tiếp
Vi sinh vật sống và chết đều có khả năng ngưng kết với kháng thể. Với vi sinh vật sống, thực hiện phản ứng trên một phiến kính. Phản ứng này thường được dùng để nhận mặt vi khuẩn. Ngoài vi khuẩn, các tếbào như hồng huyết cầu, tinh trùng... đều có khả năng ngưng kết với kháng thể đối ứng.
Trường hợp kháng nguyên là vi sinh vật chết, thực hành phản ứng trong ống thử để xác định hiệu giá kháng thể ở trong huyết thanh trong chẩn đoán bệnh như phản ứng Widal trong chẩn đoán bệnh thương hàn.
Phản ứng ngưng kết gián tiếp
Ở đây kháng nguyên và kháng thể chỉ ngưng kết khi có sự hiện diện của một nhân tố thứ 3. Phản ứng Coombs là một tỉ dụ. Người mẹ Rh- sinh đúa con Rh+ (kháng nguyên D). Lúc sinh con, hồng cầu Rh+ lọt vào máu người mẹ và khích động sự tạo thành kháng thể D. Kháng thể D có thể lọt qua nhau trong những lần mang thai sau. Phản ứng giữa kháng thể D và kháng nguyên D có thể phá hủy hồng cầu và gây nên chứng tan máu ở trẻ sơ sinh.
Để ngừa cho bà mẹ Rh- khỏi bị mẫn cảm hóa bởi kháng nguyên D của đứa con Rh+, tiêm vào người mẹ ngay trước khi sinh đứa con thứ nhất một lượng nhỏ kháng thể D.
Phản ứng ngưng kết tiêu cực
Kháng nguyên hòa tan được hấp phụ lên bề mặt những nền mượn như hạt bentonit, hạt latex nhưng thông dụng nhất là hồng cầu cừu. Những hạt này ngưng kết với kháng thể nhờ sự hiện diện của kháng nguyên dính vào bề mặt chúng. Những hạt này khá lớn nên phản ứng dương tính có thể khám phá bằng mắt thường. Trong trường hợp hồng cầu được sử dụng làm giá mang kháng nguyên thì phản ứng được gọi là phản ứng ngưng kết hồng cầu tiêu cực.
Để phát hiện kháng nguyên, người ta gắn kháng thể lên nền mượn. Khi kháng thể gặp kháng nguyên đặc hiệu, hiện tượng ngưng kết sẽ xuất hiện. Loại này được gọi là phản ứng ngưng kết thụ động ngược.
Phản ứng ngưng kết tiêu cực nhạy hơn phản ứng ngưng kết trực tiếp nhờ hình thể tương đối lớn của những hạt mang kháng nguyên và độ đặc hiệu cao hơn phản ứng ngưng kết trực tiếp vì có thể tinh luyện được các kháng nguyên hoặc kháng thể trước khi gắn lên nền mượn. Loại phản ứng này được dùng trong chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm trùng như dịch hạch, Whitmore, viêm màng não mủ...
Phản ứng ngăn ngưng kết hồng huyết cầu
Có một số virus có khả năng ngưng kết hồng cầu của một số động vật và phản ứng đó bị ức chế bởi kháng huyết thanh của virus. Đó là phản ứng ngăn ngưng kết hồng huyết cầu. Phản ứng ngăn ngưng kết hồng huyết cầu được dùng để chẩn đoán nhiều chứng bệnh virus như cúm, quai bị, sốt xuất huyết, đậu mùa.v.v...
PHẢN ỨNG kết hợp BỔ THỂ
Nguyên lý
Kháng thể đặc hiệu với sự dự của bổ thể sẽ gây ly giải tế bào vi khuẩn hoặc một số tế bào động vật khác.
Các tuổi tiến hành phản ứng phối hợp bổ thể
Trong phòng thí điểm người ta thực hiện phản ứng phối hợp bổ thể bằng cách ghép 2 hệ thống phản ứng:
Trong hệ thống 1, kháng nguyên được cho tác dụng với kháng thể (một nhân tố biết, một nhân tố chưa biết). Nếu kháng nguyên và kháng thể phản ứng đặc hiệu thì quờ quạng lượng bổ thể phối hợp vào phức hợp kháng nguyên - kháng thể (KN-KT)
Hệ thống thứ hai được dùng để nhận diện bổ thể tự do (không phối hợp). Thêm vào hệ thống thứ nhất những hồng huyết cầu cừu và huyết thanh kháng hồng huyết cầu cừu (hệ thống tan máu). Lúc bổ thể kết hợp vào phức hợp KN-KT của hệ thống 1 thì không còn bổ thể để ly giải hồng huyết cầu cừu đã mẫn cảm hóa. Nếu ở hệ thống 1, kháng nguyên và kháng thể không phản ứng đặc hiệu với nhau thì bổ thể tự do phối hợp với phức hợp hồng cầu cừu - kháng hồng cầu cừu và do đó làm tan hồng cầu cừu. thành ra đọc kết quả phản ứng dương tính lúc không có tan máu và âm tính lúc có tan máu.
Phản ứng phối hợp bổ thể được dùng để chẩn đoán bệnh tim la, bệnh virus cũng như để nhận diện kháng nguyên và kháng thể.
CÁC PHẢN ỨNG TRUNG HÒA
Nguyên lý
Kháng thể đặc hiệu có khả năng trung hoà độc tố, độc lực của vi sinh vật, làm mất đi một tính chất nào đó của vi sinh vật hoặc sản phẩm của nó.
Phản ứng trung hòa độc tố
Độc tố nói ở đây là ngoại độc tố. Nêú một liều chí mạng hay lớn hơn độc tố được hỗn tạp với một lượng thích nghi kháng độc tố đối ứng rồi tiêm hỗn hợp vào một động vật nhạy cảm thì con vật không bị hiểm. Tính độc của độc tố đã bị kháng độc tố trung hòa. Cũng như những phản ứng miễn nhiễm khác, phản ứng này rất đặc hiệu: một độc tố chỉ trung hòa với kháng độc tố ứng.
Lượng kháng độc tố cần thiết để trung hòa một lượng độc tố phụ thuộc với cách thức hổ lốn 2 cấu trúc với nhau vì tùy theo điều kiện thử nghiệm độc tố có khả năng phối hợp với kháng độc tố ở những tỷ lệ khác nhau. Nếu thay vì cho một lượng độc tố đã biết vào một lượng kháng độc tố để trung hòa, người ta cho lượng độc tố làm hai lần vào lượng kháng độc tố thì hỗn tạp không trung hòa đối với động vật thử nghiệm. Đó là hiện tượng Danysz. Người ta cho rằng lúc cho nửa lượng độc tố vào kháng độc tố thì độc tố phối hợp với nhiều kháng độc tố hơn và do đó số lượng phân tử kháng độc tố tự do còn lại ít không đủ để trung hòa lượng độc tố còn lại.
Phản ứng trung hòa virus
Nhiều loài virus phát triển ở nuôi cấy tế bào thì phá hủy các tế bào (hiện tượng tế bào bệnh lý) nhưng nếu cho kháng thể ứng của virus vào song song với virus thì virus bị trung hòa không nhân lên được và hiện tượng tế bào bệnh lý không xảy ra. Phản ứng này được sử dụng để xác định hàm lượng kháng thể trong huyết thanh cũng như định type virus.
Mặt khác cũng có thể định lượng kháng thể của virus ở trong huyết thanh bằng cách hẩu lốn kháng huyết thanh với virus rồi tiêm hỗn tạp vào một nhóm động vật mẫn cảm. Nếu động vật thể nghiệm không cho thấy triệu chứng bệnh thì sự hiện diện của kháng thể trung hòa đã được chứng minh.
Phản ứng trung hòa enzyme
Nhiều enzyme của vi khuẩn có thuộc tính sinh kháng tốt và kích thích sự tạo thành kháng thể như streptolysin O, streptokinase của liên cầu kích động sự tạo thành kháng streptolysin O (antistreptolysin O - ASO), kháng streptokinase (anti streptokinase - ASK). Dựa trên nguyên tắc phản ứng trung hòa có thể định lượng kháng streptolysin O (ASO), kháng streptokinase (ASK) có trong huyết thanh của bệnh nhân để chẩn đoán nhiễm liên cầu. Đặc biệt phản ứng ASO phát hiện kháng thể kháng streptolysin O được sử dụng trong chẩn đoán bệnh thấp tim và viêm cầu thận cấp sau nhiễm liên cầu nhóm A.
PHẢN ỨNG miễn dịch HUỲNH QUANG
Nguyên lý
Những thuốc nhuộm huỳnh quang như Fluorescein, Rhodamin có thể phối hợp với kháng thể mà không phá hủy tính chất đặc hiệu của kháng thể. Kháng thể liên hiệp ấy có khả năng kết hợp với kháng nguyên và phức hợp KN-KT có thể quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang.
Phương pháp trực tiếp
Kháng thể được liên hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang rồi cho tác dụng với kháng nguyên. ví dụ trong chẩn đoán vi khuẩn tả sau 6 - 8 giờ nuôi cấy ở nước pepton kiềm, làm một phiến phết rồi nhuộm với kháng huyết thanh liên hợp với Fluorescein. Quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang, ta phát hiện thấy khuẩn tả phát huỳnh quang xanh lục nếu mầu phân dương tính.
Phương pháp gián tiếp
Kháng thể được cho tác dụng trực tiếp với kháng nguyên rồi cho kết hợp với kháng globulin người liên hiệp với Fluorescein. đầu tiên cho kháng nguyên một mực lên tiêu bản rồi cho tác dụng với huyết thanh bệnh nhân, rửa để loại bỏ kháng thể thừa sau đó nhỏ một giọt globulin người gắn Fluorescein rồi quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang. Phương pháp này được dùng để chẩn đoán bệnh giang mai (phản ứng FTA - Abs), bệnh tự miễn... Phương pháp gián tiếp có nhiều ưu điểm như: Sự phát huỳnh quang mạnh hơn, tiết kiệm được thời kì nếu nhiều huyết thanh được thí điểm cùng một lúc.
PHẢN ỨNG miễn nhiễm ENZYME (Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)
Nguyên lý: Kỹ thuật này dùng kháng thể hoặc kháng nguyên cố định vào một tấm polystyren. Sau đó nó được dùng để bắt kháng nguyên hoặc kháng thể đối ứng ở dung dịch thí điểm và phức hợp được phát hiện nhờ enzyme gắn với kháng thể hoặc kháng nguyên tác động lên cơ chất đặc hiệu. Cơ chất của enzyme thủy phân đo ở quang phổ kế, tỷ lệ với nồng độ của kháng thể hoặc kháng nguyên không biết ở trong dung dịch thử nghiệm.
Kháng nguyên hoặc kháng thể liên hiệp với enzyme vẫn giữ hoạt tính miễn dịch. Enzyme được dùng có thể là photphatase kiễm hoặc peroxydase. thử nghiệm cho kết quả khách quan và rất nhạy. thể nghiệm miễn dịch kết liên enzyme được áp dựng để chẩn đoán những vi khuẩn như giang mai, Brucella, Salmonella , vi khuẩn tả..và các virus như virus viêm gan, virus sởi, virus rota...
PHẢN ỨNG miễn nhiễm PHÓNG XẠ (Radioimmunoassay: RIA)
Nguyên lý: Dùng đồng vị phóng xạ như Thymidin H 3 Cacbon 14, I 125 ... đánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể để theo dõi phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể.
Có thể xác định vị trí của kháng nguyên (hoặc kháng thể) đã đánh dấu đồng vị phóng xạ bằng cách cho nhũ tương ảnh lên trên tiêu bản tổ chức học, sau đó phát hiện bằng các phương pháp chụp ảnh thông thường. Để phát hiện và đo lường đồng vị phóng xạ trong môi trường lỏng, ví dụ các đồng vị phát xạ beta (như thymidin H3, Cacbon C 14 ), cần dùng một dung dịch lấp láy và đo trong máy đếm tự động. Phương pháp đồng vị phóng xạ chẳng những có thể khu trú vị trí kết hợp một cách xác thực mà còn làm tăng độ nhạy cảm phản ứng lên hàng nghìn lần.
KỸ THUẬT SẮC KÝ miễn nhiễm
Nguyên lý: Phức hợp kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu được phân bố đều trên bản giấy sắc ký. Kháng nguyên (KN) đặc thù của vi sinh vật được gắn nhất mực tại “vạch phản ứng”. Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thể (KT) lên bản sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ phối hợp với KKT gắn màu, phức hợp miễn nhiễm KT-KKT gắn màu này chuyển di trên giấy sắc ký sẽ bị giữ lại tại “vạch phản ứng” do KT phối hợp với KN vi sinh vật, kết quả “vạch phản ứng” hiện màu. Nếu trong huyết thanh không có KT đặc hiệu, ở “vạch phản ứng” KN không thể giữ được KKT gắn màu, bởi vậy không hiện màu.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ CÁC PHẢN ỨNG phối hợp KHÁNG NGUYÊN KHÁNG THỂ
Trong nhận định kết quả của các phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể trước nhất phải lưu ý đến độ nhạy
Kết quả định tính
Kết quả định tính cho biết trong mẫu xét nghiệm có hay không có kháng thể hoặc kháng nguyên. thông thường kết quả các phản ứng được ký hiệu bằng các mức độ dương tính (+, + +, + + +) , không rõ dương tính hay âm tính (+/-), âm tính (-). Các ký hiệu này tuy có tiêu chuẩn quy định nhưng phụ thuộc vào chủ quan của người đọc kết quả.
Kết quả định lượng
Chẩn đoán gián tiếp các bệnh nhiễm trùng qua việc xác định kháng thể trong huyết thanh được gọi là chẩn đoán huyết thanh học. Kết quả định lượng trong chẩn đoán huyết thanh cho biết hiệu giá kháng thể. Nồng độ kháng thể trong huyết thanh cao hay thấp được đánh giá qua hiệu giá kháng thể. thường nhật kháng thể người bệnh được pha loãng dần theo cấp sô 2 hoặc 4. Đậm độ huyết thanh thấp nhất cho kết quả dương tính thì đậm độ đó là hiệu giá.
Các phản ứng định lượng cấp thiết để theo dõi động lực kháng thể của các huyết thanh kép thường lấy cách nhau 7 ngày. Động lực kháng thể là đại lượng đặc trưng cho chừng độ thay đổi hiệu giá kháng thể theo thời gian. Trong nhận định, quan trọng là số thương chứ không phải hiệu số giữa hai lần kết quả. Đối với bệnh virus hiệu giá kháng thể tăng lên 4 lần mới có giá trị chắc chắn.
Ranh giới hiệu giá
Là ranh giới giữa hiệu giá kháng thể thường ngày và hiệu giá bệnh lý. Liên cầu thường cư trú ở hồ hết mọi người nên trong huyết thanh của hầu hết mọi người đều có kháng thể kháng streptolysin O (ASO). thành thử người ta xem 1/200 (200 đơn vị /ml), là hiệu giá ranh giới. Chỉ khi nào trong huyết thanh có 400 đơn vị/ml trở lên mới là bệnh lý.
Kết quả dương tính giả
Hay gặp lúc bội nghịch ứng huyết thanh học vì kỹ thuật và trong một vài dạng sinh lý bệnh lý của người bệnh.
Trong huyết thanh học cổ điển chẩn đoán tim la với các kháng nguyên lipoit có thể thấy nhiều kết quả dương tính giả (sốt rét, một số bệnh ký sinh trùng khác...). Trong thực tại người ta thực hiện nhiều phản ứng huyết thanh học khác nhau cùng một lúc để rà soát dương tính giả. ví dụ Kolmer, Kaln, VDRL và nhất là dùng các kháng nguyên đặc hiệu để tránh dương tính giả, tỉ dụ TPI, FTA-Abs...
Kết quả âm tính giả
Có nhiều nguyên do dẫn đến hiện tượng âm tính giả thử: các thành phần dự phản ứng không được chuẩn độ, lượng kháng thể quá nhiều so với kháng nguyên và trái lại, kháng thể mẫu hoặc kháng nguyên mẫu bị hỏng...
Để khắc phục hiện tượng dương tính giả, âm tính giả phải chuẩn độ các thành phần tham dự phản ứng, bảo đảm đúng các điều kiện của phản ứng (dung dịch đệm, nhiệt độ, thời gian ủ...) và phải luôn luôn có chứng dương, chứng âm.
Hanya blogger biasa yang suka berkelana di dunia maya mencari seonggok informasi yang kiranya dapat berguna untuk dirinya. Terimakasih telah membacanya.
