HBV đo tải lượng Real-time PCR
MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
Mục đích
Đo số lượng bản sao HBV DNA trong một đơn vị thể tích huyết thanh hoặc huyết tương (copies/ml).
Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Real-time PCR.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và chuẩn y kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
công cụ, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
Bộ lưu điện.
Máy ủ nhiệt.
Máy ly tâm dung cho tube 0,2 ml.
Máy ly tâm 25000 x g.
Tủ lạnh 2ºC - 8ºC.
Tủ âm sâu (-20ºC) hoặc (-70ºC) (nếu có).
Máy vortex.
Tủ an toàn sinh học.
Micropipettes các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.
dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 10 mẫu/lần thực hành (VD).
|
STT |
phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Bông |
Kg |
0,001 |
|
2 |
Dây garô |
Cái |
0,001 |
|
3 |
Cồn |
ml |
1,000 |
|
4 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
1,000 |
|
5 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
6 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
7 |
Hộp tải bệnh phẩm |
Test |
0,001 |
|
8 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
2,000 |
|
9 |
Găng không có bột tal |
Đôi |
0,500 |
|
10 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
11 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng và rà chất lượng |
Test |
0,400 |
|
12 |
Kít tách DNA |
Test |
1,400 |
|
13 |
HBV Standard |
Bộ |
1,200 |
|
14 |
EQAS (nếu thực hiện)* |
0,02 |
|
|
15 |
Ependoff 1,7ml |
Tube |
2,200 |
|
16 |
Ependoff 0,2ml |
Tube |
1,000 |
|
17 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
1,000 |
|
18 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
1,200 |
|
19 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
2,200 |
|
20 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
3,200 |
|
21 |
Ethanol BDH |
ml |
0,500 |
|
22 |
Water-DEPC Treated |
ml |
2,000 |
|
23 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
24 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
25 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
26 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
27 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
28 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
29 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
30 |
găng xử lý phương tiện |
Đôi |
0,020 |
|
31 |
áo quần bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
32 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
33 |
Cồn khử trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
34 |
Dung dịch sát trùng |
ml |
10,000 |
|
35 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,010 |
* chú thích: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) ) là 1/50 tổng Chi phí phương tiện, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm làng nhàng 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn phần.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông báo theo mẫu yêu cầu.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hành theo công cụ, hóa chất được tỉ dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (xem phụ lục 3).
từ khước những bệnh phẩm không đạt đề nghị (xem phụ lục 6).
Tiến hành kỹ thuật :
Bộ sinh phẩm HBV Real-time Quant (VD).
Tách chiết DNA.
thực hành phản ứng real-time PCR.
thực hành bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần.
Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để vớ dung dịch nằm dước đáy tube.
Cho chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube HBV qPCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR cùng với 1 bộ standard.
phát động máy real-time PCR. phát động máy tính và chương trình realtime PCR.
Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
Chọn màu “FAM” cho standard. Màu “FAM” và “HEX” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.
Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.
Lưu file dữ liệu vào máy tính.
Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Điều kiện của phản ứng
Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM dương tính và đường trình diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc âm tính.
Chứng âm có đường trình diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường trình diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính.
phân tách standard
Hệ số tuyến tính (R 2 ) phải nằm trong khoảng 0.960-1.000, tốt nhất 0.9901.000.
Hiệu suất nhân văn (PCR efficiency) phải nằm trong khoảng 90-115%, tốt nhất 95-110%.
Hệ số dốc (Slope) phải nằm trong khoảng -3 đến -4, tốt nhất -3.3 đến -3.6.
Phân tích mẫu
Ngưỡng phát hiện của bộ kit là 3x10 2 copies/ml.
Những mẫu dương tính chỉ cần chọn màu FAM để phân tách.
Các kết quả dương tính được nhân với hệ số pha loãng tuỳ thuộc vào loại kit tách chiết DNA sẽ thu được kết quả hàm lượng virus/ml máu (copies/ml), do đó kết quả sau khi nhân:
+ Nếu ≥ 3x10 2 thì kết luận “Mẫu dương tính: a copies/ml”.
+ Nếu
< 3x10
Những mẫu âm tính, chứng nội phải dương tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.
In đồ thị kết quả
NHỮNG sơ sót VÀ XỬ TRÍ
Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng thông thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
căn do:
Có thể mẫu âm thực thụ, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
Khắc phục
Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại bít tất thí điểm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng đề nghị.
Trừ những mẫu sự cố, toàn bộ các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.
Hanya blogger biasa yang suka berkelana di dunia maya mencari seonggok informasi yang kiranya dapat berguna untuk dirinya. Terimakasih telah membacanya.
