VZV Real-time PCR
MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
Mục đích
Xác định sự có mặt gen đặc trưng của Varicella zoster virus (VZV) trong dịch não tủy, dịch vết loét hoặc mảnh sinh thiết ở người.
Nguyên lý
Xác định gen đặc trưng của Varicella zoster virus (VZV) dựa trên nguyên lý của kỹ thuật real-time PCR.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Người thực hành: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng thực về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và ưng chuẩn kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
công cụ, hóa chất
công cụ, hóa chất như tỉ dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
Bộ lưu điện.
Máy ủ nhiệt.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy vortex.
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Tủ lạnh 2ºC - 8ºC.
Tủ âm sâu (- 20ºC hoặc -70ºC).
Micropipette các thể tích từ 5 µl - 1000 µl.
phương tiện, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
thực hành xét nghiệm 02 mẫu/lần.
|
STT |
tổn phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Tăm bông diệt trùng |
Cái |
1,000 |
|
2 |
Tube đựng bệnh phẩm sát trùng |
Cái |
1,000 |
|
3 |
Găng không có bột tal |
Đôi |
0,100 |
|
4 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
5 |
Hộp chuyên chở bệnh phẩm |
Cái |
0,001 |
|
6 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
7 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, thẩm tra chất lượng |
Test |
1,200 |
|
8 |
Kit tách DNA |
Test |
2,200 |
|
9 |
Ngoại kiểm (nếu có)* |
0,020 |
|
|
10 |
ống Falcol 50 ml |
Cái |
0,010 |
|
11 |
Eppendorf 1,7 ml |
Tube |
2,200 |
|
12 |
Eppendorf 0,2 ml |
Tube |
2,200 |
|
13 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
2,200 |
|
14 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
1,200 |
|
15 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
5,200 |
|
16 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
3,200 |
|
17 |
Water-DEPC Treated |
ml |
1,000 |
|
18 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
19 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
20 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
21 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
22 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
23 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
24 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
25 |
bít tất tay không bột tal |
Đôi |
0,100 |
|
26 |
bít tất tay xử lý công cụ |
Đôi |
0,020 |
|
27 |
áo xống bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
28 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
29 |
Cồn vô trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
30 |
Dung dịch diệt trùng |
ml |
10,000 |
|
31 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,010 |
* chú thích: hoài ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng hoài phương tiện, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Dịch não tủy, dịch vết loét hoặc mảnh sinh thiết ...
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu đề nghị.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo Phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 3.
từ khước những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6.
Tiến hành kỹ thuật
Bộ sinh phẩm Real-time PCR định tính Varicella zoster virus (VD).
Tách chiết DNA
Có thể dùng kit tách chiết DNA bằng hoá chất phenol/chloroform hoặc tách chiết bằng cột của các nhà sản xuất khác như Qiagen, Stratec, Roche...
thực hành phản ứng real-time PCR
thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để quờ dung dịch nằm dước đáy tube.
Cho chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube VZV rPCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.
Khởi động máy real-time PCR. phát động máy tính và chương trình realtime PCR.
Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
Chọn màu “CY5” và “HEX” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.
Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.
Lưu file dữ liệu vào máy tính.
Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Điều kiện của phản ứng
Chứng dương có đường trình diễn tín hiệu huỳnh quang màu CY5 dương tính và đường trình diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc âm tính.
Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu CY5 âm tính và đường trình diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính
phân tách mẫu
Những mẫu dương tính chỉ cần chọn màu CY5 để phân tách, không cần quan tâm đến chứng nội, chứng nội có thể dương hoặc âm.
Những mẫu âm tính, chứng nội phải dương tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.
In đồ thị kết quả
NHỮNG sơ sót VÀ XỬ TRÍ
Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
nguyên cớ
Có thể mẫu âm đích thực, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
Khắc phục
Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hành lại quờ thí điểm từ bước tách chiết.
Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng đề nghị.
Trừ những mẫu sự cố, tất tật các mẫu thường nhật đều có thể lấy kết quả.
Hanya blogger biasa yang suka berkelana di dunia maya mencari seonggok informasi yang kiranya dapat berguna untuk dirinya. Terimakasih telah membacanya.
