HSV Real-time PCR
MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
Mục đích
Phát hiện DNA đặc trưng của virus herpes trong dịch não tủy, dịch vết loét hoặc mảnh sinh thiết.
Nguyên lý
Phát hiện DNA đặc trưng của virus herpes dựa trên nguyên lý của kỹ thuật real-time PCR.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng thực về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và ưng chuẩn kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
công cụ, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
Bộ lưu điện.
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy ủ nhiệt - Máy vortex.
Tủ lạnh 2ºC - 8ºC.
Tủ âm sâu (- 20ºC hoặc -70ºC).
Micropipette các thể tích từ 5 µl - 1000 µl.
dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần.
|
STT |
uổng hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Bông |
Kg |
0,001 |
|
2 |
Bơm kim tiêm 10 ml |
Cái |
1,000 |
|
3 |
Lọ sát trùng |
Cái |
1,000 |
|
4 |
Cồn |
ml |
1,000 |
|
5 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
6 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
7 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Cái |
0,001 |
|
8 |
Găng không có bột tal |
Đôi |
0,010 |
|
9 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
10 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, soát chất lượng |
Test |
1,200 |
|
11 |
Kit tách DNA |
Test |
2,200 |
|
12 |
Ngoại kiểm (nếu có)* |
0,020 |
|
|
13 |
ống Falcol 50ml |
Cái |
0,010 |
|
14 |
Eppendorf 1,7ml |
Tube |
2,200 |
|
15 |
Eppendorf 0,2ml |
Tube |
2,200 |
|
16 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
2,200 |
|
17 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
1,200 |
|
18 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
5,200 |
|
19 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
3,200 |
|
20 |
giấy dậm |
Cuộn |
0,100 |
|
21 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
22 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
23 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
24 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
19 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
21 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
22 |
bao tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
23 |
áo quần bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
24 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
25 |
Cồn diệt trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
26 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
27 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,010 |
* Ghi chú: phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng phí tổn dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm làng nhàng 3 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Dịch não tủy, dịch vết loét, mảnh sinh thiết.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu đề nghị.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo dụng cụ, hóa chất được tỉ dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: xem chi tiết phụ lục 3.
chối từ những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: xem chi tiết phụ lục 6.
Tiến hành kỹ thuật :
Bộ sinh phẩm HSV rPCR Mix (VD).
thu nạp và Xử lý mẫu
Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA (nếu cần).
Tách chiết DNA
thực hành phản ứng real-time PCR
thực hành bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần.
Cho chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube HSV rPCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.
phát động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình realtime PCR.
Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
Chọn màu “FAM” và “HEX” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.
Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.
Lưu file dữ liệu vào máy tính.
Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Điều kiện của phản ứng
Chứng dương có đường trình diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường trình diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường trình diễn âm tính).
Chứng âm có đường trình diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính.
phân tách mẫu
Mẫu dương tính: Mẫu có đường trình diễn dương tính rõ ràng và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước.
Mẫu nghi: Mẫu có đường biểu diễn dương tính và bắt đầu từ sau chu kỳ 36 → đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thực hành lại xét nghiệm sau 1-3 tháng.
Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính.
In đồ thị kết quả
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng thường ngày, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
căn do
Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
Khắc phục
Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại tuốt luốt thí điểm từ bước tách chiết.
Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.
Trừ những mẫu sự cố, tuốt luốt các mẫu thường ngày đều có thể lấy kết quả.
Hanya blogger biasa yang suka berkelana di dunia maya mencari seonggok informasi yang kiranya dapat berguna untuk dirinya. Terimakasih telah membacanya.
